Entwicklung einer lichtinduzierten Proteinsynthese in optogenetisch aktivierbaren Säugerzellen für therapeutische Applikationen

verfasst von

Nina Louisa Wichert

betreut von

Cornelia Blume

Abstract

In der Optogenetik, einer Kombination aus Optik und Genetik, werden Zellen durch genetische Manipulation lichtempfindlich, sodass Zellfunktionen gezielt durch Licht gesteuert, Krankheiten analysiert und neue Ansätze für Heilmethoden entwickelt werden können. Ein optogenetisches System besteht meist aus zwei Transkriptionsfaktoren, die unter Lichtaktivierung eines Chromophors eine Einheit bilden, der den Promotor der Zielsequenz aktiviert und die Proteinsynthese startet. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer lichtinduzierten Proteinsynthese in optogenetisch aktivierbaren humanen Zellen für therapeutische Applikationen. Es könnten z. B. patienteneigene mesenchymale Stammzellen (hMSCs) während der Implantation auf dem CI (Cochleaimplantat) platziert werden, die auf Lichtinduktion hin BDNF (brain-derived neurotropic factor) synthetisieren. BDNF hat einen positiven Effekt auf Spiralganglionzellen, die wiederrum die auditorische Vermittlung von CIs verbessern. Durch die gute zeitliche und räumliche Auflösung optogenetischer Systeme wird umliegendes Gewebe geschont und ungewollte Nebeneffekte minimiert. Als Modellzellen wurden Säugertierzellen verwendet. Eine Etablierung des optogenetischen PhyB (phytochrome B)-Systems in CHO-K1 (Chinese Hamster Ovary) Zellen mit EGFP (green fluorescent protein) Marker führte nach Optimierung zu einer 5-mal höheren Proteinexpression im Vergleich zur Leakage, während beim CRY2 (Cryptochrome 2)-System in HEK293 (human embryonic kidney) Zellen mit Luciferase (Luc) Marker eine um den Faktor 26 gesteigerte Proteinexpression erzielt wurde. Eine Analyse der Genexpression mittels qPCR (quantitative Polymerase-kettenreaktion) bestätigte diese Ergebnisse. Beide Systeme konnten sowohl mittels LED-Induktion (light emitting diode) wie auch durch Laser-Induktion aktiviert werden und das Protein BDNF optogenetisch synthetisiert werden, wobei nur das CRY2-System eine therapeutisch relevante Konzentration erzeugte. Für eine Übertragung dieser Systeme auf hMSCs, hier aus Fettgewebe isoliert, wurden diverse Transfektionsmethoden getestet. Eine chemische Transfektion (mit DreamFect™ Gold) lieferte mit einer Einzel-Transfektionseffizienz von ca. 35 % zwar die besten Ergebnisse, lag aber mit einer Ko-Transfektionseffizienz lediglich bei 6 %. Somit ist sie in dieser Form noch nicht für therapeutische Anwendungen nutzbar.

Organisationseinheit(en)

Institut für Technische Chemie

Typ

Dissertation

Anzahl der Seiten

228

Publikationsdatum

2023

Publikationsstatus

Veröffentlicht

Ziele für nachhaltige Entwicklung

SDG 3 – Gute Gesundheit und Wohlergehen

Elektronische Version(en)

https://doi.org/10.15488/13719 (Zugang: Offen)